北京大学开发新一代高灵敏度单细胞技术

北京大学开发新一代高灵敏度单细胞技术itChIP

2019年9月3日，北京大学何爱彬课题组在Nature Cell Biology发表了题为Profiling chromatin state by single-cell itChIP-seq 的文章，报道了一种新的具有普适性，易操作的单细胞ChIP-seq技术，并将这一技术命名为itChIP（simultaneous indexing and tagmentation-basedChIP-seq）。不同于该课题组开发的CoBATCH单细胞ChIP-seq技术（Molecular Cell | 何爱彬组开发高通量、普适性单细胞ChIP-seq技术——CoBATCH），单细胞itChIP-seq的一大亮点是，这项技术不仅适用于上千个单细胞的捕获，同时也可用于捕获起始量只有几十个单细胞的样品。这为研究稀少细胞样品例如植入前胚胎等的表观调控异质性提供了新的技术手段。

在itChIP实验中，研究人员采用Tn5转座酶切割DNA，切割完的DNA直接带上可供PCR扩增的DNA序列。巧妙之处在于，研究人员用甲醛交联样品，然后在高温下用SDS处理细胞，这样能使全基因组染色体变得松散，同时不会影响蛋白质与DNA的结合。在这种处理下，Tn5能均匀地切割染色体，而且不会产生对开放区域的偏好性（图1和图2）此前还一度较为平稳的工业用地市场。

图1 itChIP实验流程图

图2 全基因组水平分析验证itChIP实验中Tn5均匀切割染色体

研究人员首先用小鼠胚胎干细胞证明了少量细胞itChIP-seq的可行性。分别对不同细胞量级（100, 500, 10K）的细胞进行多种组蛋白修饰（H3K4me3和H3K27me3）和DNA结合蛋白（P300、RNA PolII和EZH2）的itChIP-seq，结果表明，itChIP比先前报道的少量细胞ChIP-seq方法具有更高的精确性、检出率和信噪比。

研究人员进一步拓展，巧妙地开发了一种新的单细胞ChIP-seq的方法，命名为single cell itChIP-seq。在单细胞itChIP实验中，研究人员用带有不同标签序列组合的 Tn5转座酶切割单细胞染色体，将切割完的单个细胞合并，然后裂解细胞核，释放带有不同标签序列的染色体片段，进行免疫共沉淀。（图3）。利用这一单细胞ChIP-seq方法，研究人员能在每一个单细胞中捕获平均9,000个DNA片段，并且基因组比对率能达到94%。这一单细胞方法的实验不需要依靠任何特殊设备。

图3 单细胞itChIP实验流程图

值得一提的是，研究人员开发了一种新的单细胞Mosaic Truseq两步PCR的文库制备方法。Mosaic Truseq文库可以使用Illumina标准的测序方法和平台进行测序。与高成本特殊定制的单细胞测序方法相比，一方面城市管理靠大家”14441票，Mosaic Truseq文库制备方法大大降低了测序成本；另一方面，实验人员不需要精通专业的测序知识，即可进行大规模的单细胞测序。

在胚胎发育的早期，细胞退出全能性并向内、中、外三个胚层分化过程中，原始态多能性相关增强子活性逐渐减弱。然而，具有各胚层命运的细胞出现的时间和调控机制无法通过检测大量细胞的增强子活性获得。通过单细胞itChIP对近2,000个外胚层样细胞（epiblast-like cells, EpiLCs）的H3K27ac（一种反映增强子活性的组蛋白修饰）的异质性进行分析，研究者清楚地区分出处于不同分化状态的细胞群体，并揭示在发育过程中，外胚层和内胚层的命运可能优先被决定，而中胚层分化最后发生。

为了进一步证明单细胞itChIP适用于细胞数量很少的胚胎组织样品，研究人员对胚胎期第7.75和第8.25的NKX谱系的心脏细胞同时进行了单细胞的RNA-seq和单细胞H3K27ac itChIP。通过对这两个不同维度的单细胞数据进行整合分析，研究人员发现了，在心脏干细胞向心肌细胞和内皮细胞两个不同谱系分化过程中，增强子表现出谱系特异性的激活和关闭。有趣的是，在这两个谱系分化过程中，虽然基因表达呈现出平滑的逐渐上调和下调（线性变化）的渐变趋势，但是增强子却表现出骤变式（指数级变化）的激活或者失活，这一现象说明增强子比其调控的基因表现出更强的时空特异性。综上，单细胞itChIP不仅可用于解析通量较高的细胞群体间的表观异质性，也可以用于鉴定低通量如特定分化谱系的胚胎样品或者早期胚胎样品细胞命运决定的表观调控机制。

此外，作者还建议将不同处理组样品利用barcoded Tn5切割后，混合在一起进行免疫共沉淀，这样可以消除不同组间由于实验引入的误差，同时节省大量的实验操作时间和成本。总之，这项全新的单细胞itChIP技术，将为研究重要的生物学过程，尤其是植入前胚胎细胞命运的分化和调控机制，带来新的曙光。

值得注意的是，该课题组近期（详见BioArt报道：Molecular Cell | 何爱彬组开发高通量、普适性单细胞ChIP-seq技术——CoBATCH）报道了另外一种截然不同的高通量的单细胞ChIP-seq技术—CoBATCH。本文介绍的sc-itChIP-seq方法，可适用于起始细胞数极少的珍贵样品（——100）的单细胞解析。

研究背景

染色质的表观修饰状态与基因表达和细胞命运决定密切相关。目前单细胞表观组学的研究，主要集中在DNA的化学修饰，染色质的开放程度以及3D构象等。值得注意的是，染色体上组蛋白的各种共价修饰影响着顺式作用元件的功能，DNA结合蛋白的结合决定了基因的特异性表达。因此，在单细胞水平捕获DNA互作蛋白的结合信息尤为重要，但这一技术仍面临诸多挑战。

如上所述，蛋白质和DNA相互作用的染色质免疫共沉淀技术（ChIP-seq）是一种研究表观转录调控的重要方法。尽管核酸酶MNase的引入促进了STAR-ChIP, μChIP-Seq和CUTRUN等少量细胞ChIP-seq技术的实现和优化，然而ChIP-seq技术在单细胞水平的研究一直进展缓慢。目前报道的单细胞ChIP-seq技术一方面需要特殊的微流控或者Takara ICELL8装置，另一方面得到的单细胞测序数据质量欠佳（DNA片段基因组比对率低，单细胞捕获的DNA片段少），这些因素极大地限制了单细胞ChIP-seq技术的广泛应用。所以，开发一种易操作，高质量，具有普适性的单细胞ChIP-seq技术，是单细胞表观基因组领域的科学家期盼实现的重大突破。